Noch in hellenistischer Zeit ist Makedonien, nach dem zweiten Makedonisch-Römischen Krieg, in vier Teile aufgeteilt worden. Von 168 v. Chr. bis 148 v. Chr. ist Thessaloniki Hauptstadt eines Teils Makedoniens. Mit der endgültigen Eingliederung in das Römische Reich, ist Thessaloniki zur Hauptstadt der Provinz Macedonia geworden.
Im Anschluss an die Eroberung Makedoniens 148 v. Chr. wird zwischen 146 v. Chr. und 120 v. Chr. durch den Römer Gaius Egnatius eine Ost-West-Straße über den Balkan gebaut. Diese Straße ist noch heute unter dem Namen Via Egnatia bekannt. Die Via Egnatia führt von Byzanz über Philippi, Amphipolis, Thessaloniki, Pella, Edessa nach Dyrrachium (heute Durres, Albanien). Dyrrachium ist in Römischer Zeit ein bedeutender Hafen. Von hier aus hat man nur einen kurzen Seeweg nach Brindisi, welches der Endpunkt einer anderen wichtigen Straße, der Via Appia, ist. Die Via Appia endet vor dem Stadttor Porta Capena in Rom.
Thessaloniki liegt auch an einer weiteren wichtigen Handelsrute. Die Handelsroute verbindet die Donau mit dem Ägäischen Meer. In Thessaloniki trifft sich diese Nord-Süd-Straße mit der Via Egnatia.
In der ersten Hälfte des 1. Jahrhunderts v. Chr. entsteht in Thessaloniki die erste jüdische Gemeinde. Diese jüdische Gemeinde soll im weiteren Verlauf der Geschichte die bedeutendste jüdische Gemeinde außerhalb Palästinas werden.
Um 60 v. Chr. muss Thessaloniki bereits eine sehr einflussreiche und wichtige Stadt sein, mit einem sehr großen kulturellem Angebot und fest im römischen Reich verankert. Nur So ist zu erklären, warum Cicero sich von allen Städten des Reiches Thessaloniki ausgesucht hat, um dort sein Exil von 58 bis 57 v. Chr. zu verbringen. In die Zeit des Exils Ciceros fallen auch die Überfälle der Thrakier. Die Thrakier überfallen Makedonien und plündern die Städte. Die Einwohner von Thessaloniki müssen sich in ihre Akropolis zurück ziehen. Dieses Ereignis wird vom Geschichtsschreiber Cicero beschrieben.
Philipp der Thessaloniker, ein griechischer Geschichtsschreiber, berichtet aus dem Jahr 56 v. Chr., dass die Stadt von Thrakern über Land angegriffen wird und das die Schiffe von Thessaloniki immer Piraten zu fürchten haben. Thessaloniki hat in dieser Zeit eine Bevölkerung von 250.000 Einwohnern, auch dies wird von Philipp dem Thessaloniker berichtet.
Wenige Jahre später kehrt Cicero nach Thessaloniki zurück. Die Umstände sind nicht besser als bei seinem ersten Aufenthalt in Thessaloniki. Julius Cäsar versucht militärisch die Macht über das Römische Reich zu erlangen. Die Cäsar-Feindlichen Senatoren müssen aus Rom fliehen. Somit wird Thessaloniki im Jahr 49 v. Chr. zum Sitz des Römischen Senats. Dieses Privileg währt jedoch nur ein Jahr. In der Schlacht von Pharsalos besiegt Cäsar auch seine letzten Feinde in diesem Senat und wird Diktator des Römischen Reichs. Im weiteren Verlauf des Römischen Bürgerkrieges wechselt Thessaloniki notgedrungen die Seiten. Brutus, Stiefsohn und einer der Mörder Cäsars, verspricht seiner Truppe für den Fall des Siegs die Plünderung von Thessaloniki. Aus der Schlacht in Philippi geht das Heer Octavians (später Kaiser Augustus) als Sieger hervor. Als Dank für die Unterstützung gegen Brutus wird Thessaloniki "Civitas Libera" - Freie Stadt.
Ein Meilenstein in der Geschichte von Thessaloniki ist der Besuch des Apostel Paulus in Thessaloniki. Der Apostel Paulus besucht Thessaloniki im Jahr 50 n. Chr. Der Apostel Paulus predigt südlich der Stadtmauern. Mit seinem Besuch leitet der Apostel Paulus die Christianisierung Thessalonikis ein.
Die Christianisierung ist der Beginn des Wiederstandes der Bevölkerung von Thessaloniki gegen die Römische Herrschaft. Das Rom in der Zeit nach Christi Geburt ist immer noch heidnisch. In Thessaloniki entstehen mehrere Frühchristliche Kirchen. Diese Frühchristlichen Kirchen sind jedoch noch im verborgenen. Eine der ersten Kirchen ist die Kirche Johannes des Täufers. Sie befindet sich schräg gegenüber der Hagia Sophia. In ihr kann man einen Eindruck der frühchristlichen Katakomben bekommen.
In den Jahren 254, 262 und 269 n. Chr. wird Thessaloniki von den Westgoten belagert. Bei keiner dieser Belagerungen gelingt es den Goten die Stadt einzunehmen. Die Belagerungen bedeuten aber das Ende der Pax Romana für Thessaloniki.
Thessaloniki erlangt große Bedeutung im Römischen Reich unter dem Kaiser Gaius Galerius Valerius Maximianus (250-311 n.Chr.). Galerius ist ab 290 zunächst Cäsar unter dem Kaiser Diokletian. Galerius besiegt 298 die Perser. Galerius gilt aber auch als geistiger Vater der Christenverfolgung unter Diokletian. Nach dem Rücktritt Diokletians als Kaiser, übernimmt Galerius dessen Kaiserkrone. Um das Jahr 306 n. Chr. bestimmt Galerius Thessaloniki zu seinem Regierungssitz. Der östliche Teil des Römischen Reiches wird fortan von Thessaloniki aus geleitet.
In Thessaloniki baut Galerius einige wichtige Bauwerke, welche zum Teil noch heute zu sehen sind. Zum einen ist da der Triumphbogen des Galerius, welcher heute in Thessaloniki umgangssprachlich die "Kamara"genannt wird, er baut seinen Palast, das Hippodrom und sein Mausoleum. Das Mausoleum ist heute ein Museum, diente im Lauf der Zeit als Kirche Hagios Georgios und als Moschee. In die Zeit Galerius in Thessaloniki fällt auch die Ermordung des Schutzheiligen von Thessaloniki. Hagios Dimitrios ist Offizier in der römischen Legion. Er stammt von einer Adelsfamilie aus Thessaloniki.
Agios Dimitrios tritt zum Christentum über und wird 303 n. Chr. verhaftet. Er wird im römischen Bad gefangen gehalten und dort mit einer Lanze erstochen. Auf den Fundamenten des römischen Bades entsteht später die Kirche des Hagios Dimitrios. Die Kirche des Heiligen Dimitrios ist eine der ersten offiziellen Kirchen in Thessaloniki.
Galerius verfasst 311 n. Chr. auf dem Sterbebett das Toleranzedikt von Nikomedia. Es ist das erste römische Edikt zur Gleichstellung der Christen in Rom.
Noch während der Amtszeit des Galerius, schwingt sich ein neuer mächtiger Mann in Rom zum Kaiser auf. Konstantin der Große. Nachdem er seinen Widersacher Maxentius auf der Milvischen Brücke besiegt hat, steht im nur noch sein Schwager Licinius im Weg. Für seinen Kampf gegen Licinius dem Kaiser der östlichen römischen Reichshälfte baut er den Hafen von Thessaloniki aus. Der Hafen von Thessaloniki hat nach dem Ausbau Kapazität für 200 Trieren und 2000 Handelsschiffe. Konstantin bietet ein Heer von 120.000 Mann gegen Licinius auf. Licinius wird 324 n. Chr. von Konstantin bei der Schlacht von Chrisoupoli geschlagen und abgesetzt. 325 n. Chr. wird Licinius in Thessaloniki hingerichtet. Konstantin der Große ist alleiniger römischer Kaiser.
Konstantin reformiert das Römische Reich dahingehend, dass er das Reich teilt. Der westliche Teil wird nach wie vor von Rom aus regiert. Der oströmische Teil wird von Byzanz aus gesteuert. Diese Reichsteilung findet am 10. Mai 330 n. Chr. statt. Konstantin benennt die alte griechische Stadt nach sich selbst. Er gibt Byzanz den Namen Konstantinopel.